Anwendung spektroskopischer Messverfahren und Multivariater Datenanalyse zur Bewertung und Beobachtung von Bioprozessen
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Bioprozessmonitoring unter Verwendung spektroskopischer Messverfahren und multivariater Datenanalyse nach den Grundsätzen von PAT – Process Analytical Technology. Mit NIR-Spektroskopie und dem Verfahren Soft Independent Modelling of Class Analogy (SIMCA) wurde eine Quali¬tätsbewertung von Hefeextrakten realisiert. Im Vordergrund stand jedoch die Quanti¬fizierung nicht direkt messbarer Größen aus NIR-, Raman- und 2D-Fluoreszenzspektren in pharmazeutischen Produktionsprozessen mit Pichia pastoris. Eine entsprechende Online-Bestimmung mit der Methode Partial Least Squares Regression (PLSR) kam weiterführend zur Regelung der Glycerolkonzentration zum Einsatz. Darüber hinaus wurde die Verwendung nichtspektraler Online-Daten zur Prozessbeobachtung erprobt. Dabei gelang mit Hilfe des nichtlinearen Verfahrens Support Vector Regression (SVR) unter anderem die Bestimmung zellspezifischer Reaktionsraten.
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Schlagworte
- I–XVI
- 1–3 1. Einleitung und Zielsetzung 1–3
- 1.1 PAT ‒ Ein Werkzeug moderner pharmazeutischer Produktion
- 1.2 Zielsetzung dieser Arbeit
- 4–6 2. Mikro- und molekularbiologische Grundlagen 4–6
- 2.1 Das potentielle Malariavakzin D1M1H als Zielprodukt
- 2.2 Das eingesetzte Expressionssystem
- 2.2.1 Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris
- 2.2.2 Transformation des Organismus
- 7–17 3. Eingesetzte Bioprozesstechnik 7–17
- 3.1 Kultivierung von Pichia pastoris
- 3.1.1 Der klassische Herstellungsprozess rekombinanter Proteine
- 3.1.2 Intensivierung der Produktion durch zyklische Prozessführung
- 3.2 Die verwendete Bioreaktoreinheit
- 3.3 Erweiterte MSR- und Automatisierungstechnik
- 3.3.1 Automatisierungsaufgaben
- 3.3.2 Der substratlimitierte Glycerol-Fed-Batch
- 3.3.3 Online-Estimierung der Zelldichte
- 3.3.4 Inline-Messung und Regelung der Methanolkonzentration
- 3.3.5 Atline-Quantifizierung des Zielproduktes
- 3.3.6 Realisierung der zyklischen Fahrweise
- 3.3.7 Abgasanalyse und Gasbilanzen
- 3.4 Prozessbegleitende Offline-Analysentechnik
- 3.4.1 Probenahme
- 3.4.2 Zelldichtebestimmung
- 3.4.3 Glycerol- und Methanolanalytik
- 3.4.4 Ammoniummessung
- 3.4.5 Gesamtproteinbestimmung
- 3.4.6 Enzymatischer Alkoholoxidasenachweis
- 3.4.7 Berechnung von Konzentrationen in der Flüssigphase
- 18–26 4. Spektroskopische Messverfahren als erweiterte PAT-Werkzeuge 18–26
- 4.1 Eine Übersicht über PAT-Analysatoren
- 4.2 Eingesetzte Spektroskopieverfahren
- 4.2.1 Nahinfrarotspektroskopie
- 4.2.2 Raman-Spektroskopie
- 4.2.3 2D-Fluoreszenzspektroskopie
- 4.3 Extraktion relevanter Informationen aus Spektren
- 27–55 5. Einführung in die Multivariate Datenanalyse (MVDA) 27–55
- 5.1 Zielsetzung bei der Anwendung der MVDA
- 5.2 Datenvorbereitung
- 5.2.1 Struktur und Modifizierung multivariater Datensätze
- 5.2.2 Zentrierung und Skalierung
- 5.2.3 Datenvorverarbeitung für Spektren
- 5.3 Die Hauptkomponentenanalyse (PCA)
- 5.3.1 Dimensionsreduktion durch Hauptkomponenten
- 5.3.2 Das mathematische Modell der PCA
- 5.3.3 Berechnung der Hauptkomponenten
- 5.4 Partial Least Squares Regression (PLSR)
- 5.4.1 Multivariate Kalibrierung mittels PLSR
- 5.4.2 Das mathematische Modell der PLSR
- 5.4.3 Berechnung der PLS-Komponenten
- 5.5 Erstellung multivariater Modelle
- 5.5.1 Generelle Anforderungen an das Datenmaterial
- 5.5.2 Ausreißerdetektion für multivariate Daten
- 5.5.3 Variablenselektion
- 5.5.4 Validierung multivariater Modelle
- 5.6 Multivariate Klassifizierung
- 5.6.1 Allgemeine Informationen
- 5.6.2 Soft Independent Modelling of Class Analogy (SIMCA)
- 5.6.3 Validierung von Klassifikatoren
- 5.7 Support Vector Machines (SVM)
- 5.7.1 SVM als multivariates Klassifizierungsverfahren
- 5.7.2 Berechnung einer optimalen Trennebene
- 5.7.3 Kernel-Funktionen zur Abbildung nichtlinearer Beziehungen
- 5.7.4 Erweiterung zur Support Vector Regression (SVR)
- 5.8 Eingesetzte MVDA-Software
- 56–65 6. Qualitätsbewertung von Hefeextrakten mit NIR-Spektroskopie 56–65
- 6.1 Motivation und Zielsetzung
- 6.2 Stand der Wissenschaft
- 6.3 Der gewählte Messaufbau
- 6.4 Vorstellung des Probenpools
- 6.5 Vorverarbeitung der Spektraldaten
- 6.6 Explorative Datenanalyse und Probenselektion
- 6.7 Entwicklung eines SIMCA-Klassifizierungsmodells
- 6.8 Externe Validierung des Modells
- 66–92 7. Offline-Prädiktion relevanter Variablen in Bioreaktionsprozessen 66–92
- 7.1 Eine Machbarkeitsstudie anhand von Offline-Analysen
- 7.2 Stand der Wissenschaft
- 7.3 Untersuchte Prozessgrößen und vorhandenes Probenmaterial
- 7.4 Entwicklung von PLSR-Modellen
- 7.4.1 Der komplexe Prozess der PLSR-Modellentwicklung
- 7.4.2 Eine exemplarische Darstellung bei der PLSR-Modellentwicklung
- 7.4.3 Schwierigkeiten bei Betrachtung der zellhaltigen Flüssigphase L
- 7.5 Prädiktion der Zelldichte
- 7.6 Prädiktion der Glycerolkonzentration
- 7.7 Prädiktion der Ammoniumkonzentration
- 7.8 Prädiktion der Gesamtproteinkonzentration
- 7.9 Prädiktion des zellinternen Alkoholoxidasegehaltes
- 93–109 8. Online-Monitoring mit spektroskopischen Verfahren 93–109
- 8.1 Der untersuchte zweistufige Produktionsprozess
- 8.1.1 Die verwendete Bioreaktoranlage
- 8.1.2 Die parallel/sequentielle Prozessführung
- 8.1.3 Die erweiterte Prozess-EDV zur Anwendung der MVDA
- 8.2 Skizzierung des Versuchsaufbaus
- 8.3 Prädiktion der Zelldichte und der Glycerolkonzentration
- 8.3.1 Bereitstellung geeigneten Datenmaterials
- 8.3.2 Ergebnisdarstellung
- 8.4 Prädiktion des zellinternen Alkoholoxidasegehaltes
- 8.4.1 Bereitstellung geeigneter Kalibrierdaten
- 8.4.2 Ergebnisdarstellung
- 8.5 Prädiktion der Gesamtproteinkonzentration
- 8.6 Anwendung der nichtlinearen SVR
- 110–128 9. Regelung der Glycerolkonzentration 110–128
- 9.1 Das Regelungskonzept
- 9.2 Theoretische Betrachtung des Regelungsproblems
- 9.2.1 Elemente des Regelkreises
- 9.2.2 Charakterisierung des Streckenverhaltens
- 9.2.3 Einführung des linearisierten Streckenmodells
- 9.2.4 Vernachlässigung der Dynamik des Messsystems
- 9.2.5 Regel- und Stellverhalten
- 9.3 Untersuchung der Dynamik des Regelungsproblems
- 9.3.1 Übertragungsfunktionen des Regelkreises
- 9.3.2 Eigenwerte des geschlossenen Regelkreises
- 9.3.3 Schwingungsverhalten des Regelkreises
- 9.3.4 Vorgabe des Regelkreisverhaltens
- 9.4 Technische Vorgaben der Glycerolregelung
- 9.4.1 Prozesstechnische Umsetzung
- 9.4.2 Bereitstellung der Regelgröße durch ein PLSR-Modell
- 9.4.3 Durchführung notwendiger Online-Berechnungen
- 9.4.4 Vernetzung beteiligter Softwaresysteme
- 9.5 Experimentelle Erprobung der Substratregelung
- 9.5.1 Regelung im aperiodischen Grenzfall
- 9.5.2 Regelung der Glycerolkonzentration im Schwingfall
- 129–146 10. Anwendung der MVDA auf nichtspektroskopische Daten 129–146
- 10.1 Prädiktion nicht direkt messbarer Prozessgrößen
- 10.2 Vorbereitung der Modellerstellung
- 10.2.1 Gewählte Zielgrößen
- 10.2.2 Berechnung zellspezifischer Reaktionsraten
- 10.2.3 Bereitstellung idealisierter Kalibrierdaten
- 10.2.4 Auswahl und Bereitstellung der Prädiktorvariablen
- 10.2.5 Erzeugung benötigter Datensätze und Datenvorverarbeitung
- 10.3 Ergebnisdarstellung
- 10.3.1 Prädiktion von Zustandsgrößen
- 10.3.2 Prädiktion zellspezifischer Reaktionsraten
- 147–148 11. Zusammenfassung 147–148
- 149–152 12. Anhang 149–152
- 12.1 Kulturmedien
- 12.2 Kultivierungsbedingungen
- 12.3 Reaktionskinetische Parameter
- 12.4 Offline-Messungen
- 153–159 13. Quellenverzeichnis 153–159
- 160–165 Veröffentlichungen des Autors 160–165
